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RT-qPCR操作简单高效，被全国很多诊断试剂和临床研究客户使用。本文将从反应效率、灵敏度、重复性三个方面对标准曲线进行评价，并介绍实时荧光定量PCR的四个常见难点。

一、RT-qPCR是什么？

定量实时PCR(quantitative Real-time PCR)是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用Taq酶的5-3核酸外切酶活性和荧光能量转移技术，结合核酸扩增、杂交、光谱分析和实时检测技术的方法。实时监控整个PCR反应扩增过程，并连续分析相关荧光信号。监测到的荧光信号可以绘制成随反应变化的曲线。最后，通过标准曲线分析未知核酸。

图1:图片来自互联网。如有侵权，请删除。

RT-qPCR反应由三个基本反应步骤组成：变性-退火-延伸。该技术的基本原理类似于DNA的自然复制过程，其特异性取决于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。重复变性-退火-延伸这三个过程可以得到更多的“半保守复制链”，这个新链可以成为下一个循环的模板。

完成一个循环需要2 ~ 4分钟，目的基因扩增几百万次需要2 ~ 3小时。

在荧光定量PCR技术中，有一个非常重要的概念——Ct值。c代表周期，T代表阈值，Ct值的含义是：每个反应管中的荧光信号达到设定的阈值时所经历的周期数。

RT-qPCR中，实时监测扩增过程，根据反应时间和荧光信号的变化可以绘制曲线。

图2:图片来自互联网。如有侵权，请删除。

整个曲线可分为三个阶段：荧光背景信号阶段、荧光信号指数放大阶段和平台阶段。在信号指数扩增阶段，PCR产物的对数值与初始模板量之间存在线性关系，因此在PCR反应的指数阶段的某一点检测PCR产物的量，就可以推断出模板的初始含量进行定量分析。

二、TaqMan荧光探针、SYBR荧光染料

RT-qPCR反应中使用的荧光化学可以分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下：

1、TaqMan荧光探针

在PCR扩增过程中，作为寡核苷酸的特定荧光探针与一对引物同时加入，探针的两端分别标记有报告荧光基团和淬灭荧光基团。

图3:图片来自互联网。如有侵权，请删除。

当探针完成时，报告基团发出的荧光信号被淬灭基团吸收；在PCR扩增过程中，Taq酶的5’-3’核酸外切酶活性会降解探针，将报告荧光基团与淬灭荧光基团分离，使荧光监测系统接收到荧光信号。

图4:图片来自互联网。如有侵权，请删除。

即每扩增一条DNA链，就形成一个荧光分子，实现了荧光信号的积累与PCR产物形成的完全同步。

而新的TaqMan-MGB探针不仅可以定量分析基因，还可以分析基因突变(SNPs)，有望成为基因诊断和个体化药物分析的首选。

2、SYBR荧光染料

在PCR反应系统中，加入过量的SYBR荧光染料。SYBR荧光染料特异性掺入DNA双链后，会发出荧光信号，而未掺入链中的SYBR染料分子不会发出任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

图5:图片来自互联网。如有侵权，请删除。

三、采用标准曲线评估反应效率、灵敏度和可重复性

1、反应效率

反应效率的最佳评价方法是生成标准曲线。

通过构建连续稀释的样品核酸并进行实时荧光定量PCR，生成标准曲线。然后以初始核酸量为X轴，Ct为Y轴绘制结果曲线。

冲锋队

效率在90110%的理想窗口中的标准曲线决定了RT-qPCR反应的初始模板量的可测量范围。在某种程度上，可以通过目标Ct出现在扩增曲线上的时间来确定灵敏度。

但实际测量分析灵敏度的方法是少量模板是否适合标准曲线并保持理想的扩增效率。符合要求的最高稀释度的样品决定了反应灵敏度。

标准曲线还包括R2值，用于测量重复样品的重复性。重复标准曲线以评估一致性，从而保持样品的数据准确性。

2、灵敏度和可重复性

RT-qPCR常见的难点可以归纳为四个主要方面：引物二聚体的形成、引物和探针的保存、实时荧光定量PCR的抑制和反应效率低、软件分析的设置。

图6:实时荧光定量PCR中的四个常见困难

四、RT-qPCR四方面常见困难

1.传染病的检测

2.肿瘤基因检测

3.遗传病检测

RT-qPCR反应应用：

五、凡知医学相关产品

1、Viral DNA/RNA Extraction Kit病毒DNA/RNA提取试剂盒

用途广泛：可支持血清、血浆、尿液、脑脊液、拭子浸泡液、培养上清液等各种样本。

操作方便：整个操作过程可以获得高质量的DNA/RNA；25分钟内；

无污染：能彻底去除污染物和PCR抑制剂，保证下游实验；

灵敏度高：能成功提取病毒低拷贝数的核酸；

高效率：便携式和高通量自动提取器均可使用；

产品特点：

该试剂盒采用特殊的方法裂解培养的细胞，可以直接从细胞裂解液中进行定量RT-PCR，无需RNA纯化。适用于TaqMan和SYBR Green法进行基因定量。

2、Lysate2RT Kit直扩产品

不需要提取和纯化RNA

原味裂解，无需反复转移；

操作简单，无需提取器；

有效避免PCR抑制；

高通量，可同时处理96个样品；

产品特点：

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优良的线性范围

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扩增曲线对照实验

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理想的重复性

3、Firegen VMTM一次性病毒采样管

Genvmtm是一种非灭活的鼻/口咽拭子保存液，可在4至室温下保持细胞和病毒的完整性。

病毒收集后，在储存和运输温度范围内不会降解。

样品灭活RNA在4下稳定保存1周，Ct值无变化。

不需要核酸提取，省去了提取设备和提取试剂，大大降低了检测成本和耗时。

VMTM对RT-PCR无明显抑制作用，对检测反应无不良影响。

产品特性：

一次性病毒采样管-1.png

一次性病毒采样管-2.png

采样灭活后的采集管在4存放48h、72h后的效果检测：4、新型冠状病毒冻干检测试剂盒

（实时荧光探针法）

全组分冻干技术，常温运输，无冷链，比液体试剂更可靠；

创新的单反应微球设计大大简化了操作过程；

疫情防控迅速向边远地区和贫困地区延伸，实现了病毒防控“全天候”战役。

产品特性：

新冠肺炎冻干检验试剂管的一致性检验。使用jpeg文件交换格式存储的编码图像文件扩展名

一致性测试

新冠肺炎冻干测试试剂管标准曲线。使用jpeg文件交换格式存储的编码图像文件扩展名

新冠肺炎冻干检测试剂管线图。使用jpeg文件交换格式存储的编码图像文件扩展名

标准曲线

FireGen Biomedicals是一家全球化运营的生物医药企业，由在世界顶级制药公司拥有30年经验的海外华人科学家团队创立。搭建了先进的新一代重大疾病核酸快速诊断试剂和仪器研发平台，创新研发了基因测序试剂盒、快速基因检测仪和检测芯片，推动基因快速诊断进入基层医疗体系，致力于打造中国基因快速诊断领导品牌，提供一体化诊断仪器、芯片、诊断试剂和部分高端原料。

关于凡知医学

[1]魏新贤，李，童桂香，吴.实时荧光定量PCR及其在水产动物病毒病定量检测中的应用[J].水产科学，2010，29(11):681-687。

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